Resumen

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El principal objetivo de esta línea de investigación es el desarrollo de nuevos tratamientos y de diagnóstico, basadas en los mecanismos de captación del Fe(III), contra las enfermedades infecciosas en peces de acuicultura provocadas por bacterias patógenas Gram negativas.

Nuestra aproximación consiste en aprovechar los mecanismos bacterianos de captación del hierro(III), elemento esencial para su crecimiento y desarrollo pero que posee una disponibilidad muy limitada debido a su baja solubilidad a pH fisiológico basado en el empleo de sideróforos. Estos son compuestos de bajo peso molecular que, secretados al medio de cultivo, quelatan eficazmente al hierro(III) y luego lo transportan de manera específica a través de receptores específicos de membranas al interior de las células donde lo liberan.

Nuestro trabajo se centra en el aislamiento, caracterización estructural, síntesis del/os siderofóro/os y sus análogos y su posterior conjugación con el fin de desarrollar nuevos antimicrobianos (principalmente mediante la estrategia del Caballo de Troya) y vacunas. Adicionalmente, realizamos el clonaje, la expresión en E. coli y posterior purificación de la(s) proteína(s) receptora(s) de cada uno de los sideróforos biosintetizados por las bacterias patógenas en cuestión, con el fin de ensayarla como posible vacuna y determinar su estructura tridimensional.

Nos centramos en tres de las más importantes enfermedades infecciones en acuicultura que son:



Vibriosis

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Causada por bacterias marinas pertenecientes a Vibrio anguillarum, hemos logrado aislar y caracterizar vanchrobactina como el sideróforo correspondiente al segundo sistema de transporte de hierro de esta bacteria producido por las del serotipo O2. Se logró su síntesis total y la preparación de varios análogos activos que fueron empleados en la preparación de nuevos agentes antimicrobianos siguiendo la denominada estrategia de Caballo de Troya. Dichos estudios permitieron identificar a FvtA como la proteína receptora del sideróforo en la bacteria. Se estudiaron sus complejos de hierro mediante métodos espectrofotométricos y potenciométricos (colaboración con la Dra. Emilia Iglesias, del Departamento de Química de la UDC).

Pasteurellosis

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Mediante análisis del clúster genético implicado en la biosíntesis del sideróforo biosintetizado por Photobacterium damselae subsp.piscicida, responsable de esta enfermedad, se logró la predicción y posterior aislamiento y caracterización estructural de piscibactina, así como la de prepiscibactina como un intermedio involucrado en su biosíntesis. Se propuso una posible ruta biosintética que relaciona la estructura deducida con los genes y enzimas implicados en su ensamblaje. Se llevó cabo la síntesis total de prepiscibactina y se avanzó en la de piscibactina. Se realizó el clonaje, la expresión y purificación de rFrpA, la proteína de membrana externa receptora de piscibactina, que fue ensayada exitosamente como vacuna frente a la photobacteriosis, realizándose una aproximación a su estructura tridimensional por difracción de rayos X de sus cristales.

La transmisión conjugada del plásmido pPHDP70, que codifica la biosíntesis de piscibactina, desde P. damselae subsp. piscicida a una cepa mutante de la bacteria Gram-negativa patógena de molusco, Vibrio alginolyticus a la que se le había eliminado su capacidad de producir su sideróforo vibrioferrina, permitió no solo restaurar su crecimiento en condiciones decientes de hierro sino también detectar la producción de piscibactina. Esta transferencia horizontal demuestra la facilidad con la que se puede transmitir nuevos mecanismos de captación de hierro entre bacterias, con el consiguiente resurgimiento de nuevos patógenos en el medio marino.

Forunculosis

Mediante “genome mining”·en Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida, agente causante de esta enfermedad infecciosa, se logró identificar dos tipos de clúster de genes implicados en la biosíntesis de dos clases de sideróforos distintos. Este análisis permitió primero predecir y posteriormente aislar y caracterizar estructuralmente las amonabactinas y la acinetobactina, que fue previamente identificada como el sideróforo implicado en la captación de Fe(III) de Acinetobacter baumanii. Dichos estudios permitieron además identificar a FstA como la proteína receptora del acinetobactina.

Se sintetizaron diversos análogos de acinetobactina, que permitieron no solo deducir importantes relaciones de estructura-actividad siderófora sino también identificar un análogo simplificado que puede ser utilizado como vector en la preparación de conjugados.